細胞壁固定型酵素発現によるホルムアルデヒド無毒化植物のデザイン

本デザインは、細胞壁固定型ホルムアルデヒド脱水素酵素の発現により、植物にホルムアルデヒド無毒化能を付与することを目指したものである。細胞壁結合型ホルムアルデヒド脱水素酵素は、Pseudomonas putidaのホルムアルデヒド脱水素酵素のC末端にHeterodera schachtiiのセルロース結合タンパク質を融合した後、N末端に小胞体移行シグナルを付加して作製した。この酵素は植物の細胞壁中に留まって不均化反応を触媒し、植物体を細胞外のホルムアルデヒドから効率的に保護すると期待される。また、本デザインに基づく組換え植物には、ホルムアルデヒド無毒化繊維の原料として活用できる可能性がある。

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//---------------------------------------------------------------
// window.onloadメソッド
//概要:
//	遺伝情報の組み立ての主処理。
//	本関数内で使用している独自に定義したオブジェクトDNAとProteinは
//	本コード後半で定義している。
//引数:
//	なし
//戻り値:
//	なし
//---------------------------------------------------------------
window.onload = function()
	{
		$( '#result' ).append( '<h1>Submission for GenoCon2012 Challenge B</h1>' );
		$( '#result' ).append( '<p class="message">Start!</p>' );
		try
		{
			// FDHの処理
			$( '#result' ).append( '<h2>FDH</h2>');
			$( '#result' ).append( '<h3>Loading FDH protein</h3>');
			var FDH = new Protein();
			FDH.loadSequence( 'rdf1s327i', 'protein', 'http://www.uniprot.org/uniprot/P46154' );
			FDH.write();
			$( '#result' ).append( '<p>length = ' + FDH.getLength() + ' aa</p>');
			
			$( '#result' ).append( '<h3>Addition of Signal Peptide</h3>');
			var FDHwithSP = Protein();
			FDHwithSP = FDH.addSignalPeptide( 'http://scinets.org/item/cria228s2ria228s5i' );
			FDHwithSP.write();
			$( '#result' ).append( '<p>length = ' + FDHwithSP.getLength() + ' aa</p>');
			
			$( '#result' ).append( '<h3>Reverse-translation</h3>');
			var fdh_with_sp = FDHwithSP.reverseTranslate( 'rdf1s291i', 'codon_table_of_Arabidopsis_thaliana' );
			fdh_with_sp.write();
			$( '#result' ).append( '<p>length = ' + fdh_with_sp.getLength() + ' bp</p>');
			
			//　P1の処理
			$( '#result' ).append( '<h2>P1</h2>');
			$( '#result' ).append( '<h3>Loading P1 gene</h3>');
			var p1 = new DNA();
			p1.loadSequence(  'rdf1s327i', 'dna', 'http://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/AAF26471' );
			p1.write();
			$( '#result' ).append( '<p>length = ' + p1.getLength() + ' bp</p>');
			
			$( '#result' ).append( '<h3>Cutting out Linker</h3>');
			var linker = p1.fragmentate( 187, 270 );
			linker.write();
			$( '#result' ).append( '<p>length = ' + linker.getLength() + ' bp</p>');		
			
			//CBPの処理
			$( '#result' ).append( '<h2>CBP</h2>');
			$( '#result' ).append( '<h3>Loading CBP Protein</h3>');
			var CBP = new Protein();
			CBP.loadSequence(  'rdf1s327i', 'protein', 'http://www.uniprot.org/uniprot/B0FGT7' );
			CBP.write();
			$( '#result' ).append( '<p>length = ' + CBP.getLength() + ' aa</p>');
			
			$( '#result' ).append( '<h3>Removing Signal Peptide</h3>');
			var CBPwithoutSP = CBP.fragmentate( 26, CBP.getLength() );
			CBPwithoutSP.write();
			$( '#result' ).append( '<p>length = ' + CBPwithoutSP.getLength() + ' aa</p>');
			
			$( '#result' ).append( '<h3>Reverse-translation</h3>');
			var cbp_without_sp = CBPwithoutSP.reverseTranslate( 'rdf1s291i', 'codon_table_of_Arabidopsis_thaliana' );
			cbp_without_sp.write();
			$( '#result' ).append( '<p>length = ' + cbp_without_sp.getLength() + ' bp</p>');
			
			// 各塩基配列の結合
			$( '#result' ).append( '<h2>Combine</h2>');
			$( '#result' ).append( '<h3>FDH with Signal Peptide + Linker of P1 + CBP without Signal Peptide</h3>');
			var FDH_LINKER_CBP = new DNA( fdh_with_sp, linker, cbp_without_sp, 'TAA' );
			FDH_LINKER_CBP.write();
			$( '#result' ).append( '<p>length = ' + FDH_LINKER_CBP.getLength() + ' aa</p>');
			
			$( '#result' ).append( '<p class="message">successfully-completed!<p>' );
		}
		catch( e )
		{
			$( '#result' ).append( '<p class="error">' + e + '</p>' );
		}
	};

////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////
//
//	以下は遺伝情報の組み立てのための汎用的モジュール
//
////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////

//---------------------------------------------------------------
//Sequenceクラスのコンストラクタ
//概要:
//	DNA、Proteinなどのシーケンスを格納・管理するための
//	クラスの親クラス。Sequenceクラス自体のインスタンスは生成せず
//	抽象クラスとして扱うものとする。
//引数:
//	なし
//戻り値:
//	なし
//---------------------------------------------------------------
function Sequence()
{
	//Sequenceクラスは抽象クラス
}

//---------------------------------------------------------------
//Sequenceクラスのメンバ _checkSequenceメソッド
//概要:
//	シーケンスに既定のアルファベット(塩基やアミノ酸)以外の文字
//	が含まれていないか検査し、その場合はエラーを出す。
//引数:
//	seq 検査のシーケンス対象となるシーケンスの文字列
//戻り値:
//	なし
//---------------------------------------------------------------
Sequence.prototype._checkSequence = function( seq )
	{
		var i;
		for( i = 0; i < seq.length; i++ )
		{
			var j;
			for( j = 0; j < this.constructor._alphabet.length; j++ )
			{
				if( seq.charAt( i ) === this.constructor._alphabet[ j ] )
				{
					break;
				} 
			}
			if( j === this.constructor._alphabet.length )
			{
				throw new Error( 'シーケンスデータの' + j + '番目に不正なアルファベット' + seq.charAt( i ) + 'が含まれています。' );
			}
		}
	};

//---------------------------------------------------------------
//Sequenceクラスのメンバ _checkPositionメソッド
//概要:
//	残基番号が不正でないか検査。
//引数:
//	position 検査のシーケンス対象となる残基番号
//戻り値:
//	なし
//---------------------------------------------------------------
Sequence.prototype._checkPosition = function( position )
	{
		if( position < 0 )
		{
			throw new Error( '残基番号として' + position + 'が指定されました。1以上の値を指定してください。' );
		}
		if( position > this.getLength() )
		{
			throw new Error( '残基番号として残基数よりも大きい値(' + position + ')が指定されました。' );
		}
	};

//---------------------------------------------------------------
//Sequenceクラスのメンバ setSequenceメソッド
//概要:
//	オブジェクトにDNAやタンパク質のシーケンスをセットする。
//	複数の引数を与えるとそれらの配列を準に連結してセットする。
//引数:
//	arg シーケンスの文字列か、同じクラスのオブジェクト
//戻り値:
//	なし
//---------------------------------------------------------------
Sequence.prototype.setSequence = function( arg )
	{
		var sum = '';
		var i;
		for( i = 0; i < arg.length; i++ )
		{
			if( this.constructor !== arg[ i ].constructor && ( typeof arg[ i ] ) !== 'string' )
			{
				throw new Error( '文字列以外の値あるいは異なるクラスのオブジェクトが引数として与えられました。' );
			}
			sum += arg[ i ].toString().replace( /\s/g, '' );
		}
		this._checkSequence( sum );
		this._sequence = sum;
	};

//---------------------------------------------------------------
//Sequenceクラスのメンバ loadSequenceメソッド
//概要:
//	シーケンスをLinkDataのテーブルデータから取得して、オブジェクトにセットする。
//	基本的にはLinkData.getObjectsのwrapperだが、
//	propertyの#以前の省略に対応。(例: http://linkdata.org/property/rdf1s222i#Sequence → #Sequence)
//	さらにpropertyが省略された場合には、http://linkdata.org/property/[WORK ID]#Sequenceをpropertyとする。
//引数:
//	workID		LinkDataの作品のID
//	filename	作品中のデーブルのファイル名
//	subject		主語 (表の各行の見出しに相当)
//	property	術後 (表の各列の見出しに相当)
//戻り値:
//	なし
//---------------------------------------------------------------
Sequence.prototype.loadSequence = function( workId, filename, subject, property )
	{
		var seq;
		var emp = [];
		if( property === undefined )
		{
			property = '#Sequence';
		}
		if( property.charAt( 0 ) === '#' )
		{
			property = 'http://linkdata.org/property/' + workId + property;
		}
		
		seq = LinkData.getObjects( workId, filename, subject, property );
		if( seq[0] === undefined  )
		{
			throw new Error( 'LinkDataからの配列の取得に失敗しました。' );
		}
		
		this.setSequence( seq );
	};

//---------------------------------------------------------------
//Sequenceクラスのメンバ getSequenceメソッド
//概要:
//	オブジェクトにセットされたシーケンスを取得する
//引数:
//	なし
//戻り値:
//	シーケンスの文字列
//---------------------------------------------------------------
Sequence.prototype.getSequence = function()
	{
		if( this._sequence === undefined )
		{
			throw new Error( 'シーケンスがセットされていないオブジェクトのシーケンスが参照されました。' );
		}
		return this._sequence;
	};

//---------------------------------------------------------------
//Sequenceクラスのメンバ toStringメソッド
//概要:
//	シーケンスを文字列で返す。getSequenceを流用しているだけだが、
//	これによってオブジェクトを文字列的に扱える。
//	var P = new Protein( 'ACDEFG' );
//	alert( P )
//	なし
//引数:
//	なし
//戻り値:
//	シーケンスの文字列
//---------------------------------------------------------------
Sequence.prototype.toString = function()
	{
		return this.getSequence();
	};

//---------------------------------------------------------------
//Sequenceクラスのメンバ writeメソッド
//概要:
//	シーケンスを画面に出力。
//戻り値:
//	なし
//---------------------------------------------------------------
Sequence.prototype.write = function()
	{
		var output = '';
		var i;
		var seq = this.getSequence();
		
		$( '#result' ).append( '<div class="sequence">' + seq + '</div>' );
	};

//---------------------------------------------------------------
//Sequenceクラスのメンバ getLengthメソッド
//概要:
//	シーケンスの長さを返す。
//引数:
//	なし
//戻り値:
//	シーケンスの長さ
//---------------------------------------------------------------
Sequence.prototype.getLength = function()
	{
		return this.getSequence().length;
	};

//---------------------------------------------------------------
//Sequenceクラスのメンバ fragmentateメソッド
//概要:
//	シーケンスの断片のオブジェクトを生成。
//引数:
//	start	断片のになる残基の位置 (1始まり)
//	end		断片の末尾になる残基の位置 (1始まり)
//戻り値:
//	生成された断片のオブジェクト
//---------------------------------------------------------------
Sequence.prototype.fragmentate = function( start, end )
	{
		var seq;
		var len;
		
		this._checkPosition( start );
		this._checkPosition( end );

if( start > end )
		{
			throw new Error( 'fragmentateメソッドの第1引数(' + start + ')に第2引数(' + end + ')よりも大きな値が指定されました。' );
		}

seq = this.getSequence();
		len = this.getLength();
		
		/* -1するのは先頭の一文字を0番目でなく1番目として扱うため。 */
		seq = seq.substring( start - 1, end );
		return new this.constructor( seq );
	};

//---------------------------------------------------------------
//Sequenceクラスのメンバ substituteメソッド
//概要:
//	シーケンス中の特定の範囲を置換したオブジェクトを生成する。
//引数:
//	subSeq		置換の結果、シーケンスに導入されるシーケンス。
//	start		置換の開始位置の残基番号
//	end			置換の終了位置の残基番号。
//				省略された場合はstartと同じ値がセットされる。
//				つまり、startで指定された1文字だけを置換する。
//戻り値:
//	生成され置換後のオブジェクト
//---------------------------------------------------------------
Sequence.prototype.substitute = function( subSeq, start, end )
	{
		var seq;
		
		if( end === undefined )
		{
			end = start;
		}
		
		this._checkPosition( start );
		this._checkPosition( end );
		
		if( start > end )
		{
			throw new Error( 'substituteメソッドの第2引数(' + start + ')に第3引数(' + end + ')よりも大きな値が指定されました。' );
		}
		
		subSeq = subSeq.toUpperCase();
		this._checkSequence( subSeq );
		
		seq = this.getSequence();
		seq = seq.substring( 0, start - 1 ) + subSeq + seq.substring( end );
		
		return new this.constructor( seq );
	};

//---------------------------------------------------------------
//Sequenceクラスの子クラス DNAクラスのコンストラクタ
//概要:
//	DNAのシーケンス(塩基配列)を格納・管理するためのクラス
//引数:
//	元になるDNAオブジェクトあるいはシーケンスの文字列(複数指定可)
//戻り値:
//	なし
//---------------------------------------------------------------
function DNA()
{
	this.constructor = DNA;
	
	if( arguments.length > 0 )
	{
		this.setSequence( arguments );
	}
}

// Sequenceを継承
DNA.prototype = new Sequence();

//各ヌクレオチドをDNAを構成するアルファベットとして設定。
DNA._alphabet = [ 'A', 'T', 'G', 'C' ];

//---------------------------------------------------------------
//Sequenceクラスの子クラス Proteinクラスのコンストラクタ
//概要:
//	タンパク質のシーケンス(アミノ酸配列)を格納・管理するためのクラス
//引数:
//	元になるProteinオブジェクトあるいはシーケンスの文字列(複数指定可)
//戻り値:
//	なし
//---------------------------------------------------------------
function Protein()
{
	this.constructor = Protein;
	
	if( arguments.length > 0 )
	{
		this.setSequence( arguments );
	}
}

// Sequenceを継承
Protein.prototype = new Sequence();

//アミノ酸と終止コドンに対応する*をタンパク質を構成するアルファベットとして設定。
Protein._alphabet = [ 'A', 'C', 'D', 'E', 'F', 'G', 'H', 'I', 'K',
					'L', 'M', 'N', 'P', 'Q', 'R', 'S', 'T', 'Y', 'V', 'W', '*' ];

//---------------------------------------------------------------
//Proteinクラスのメンバ addSignalPeptideメソッド
//概要:
//	シーケンスにシグナルペプチドを不可する。
//引数:
//	subject		signal peptide (http://linkdata.org/work/rdf1s292i/)
//				のテーブルデータsignal_peptideのシグナルペプチドを示す主語。
//	position	挿入位置不定の場合はシグナルペプチドの挿入位置。
//				(何番目のアミノ酸残基の後に挿入するか)
//	シグナルペプチドのシーケンス中に不特定部分XXXを含む場合には、
//	場合は3番目以降)の引数で順にXXX部分に入るシーケンスを指定する。
// 例)
// N末端挿入型シグナル XXXXRLXXXXXHL-の始めのXXXXをAAAA
// 次のXXXXXをPPPPPとして付加する場合:
// HPSPHI.addSignalPeptide( 'http://scinets.org/item/cria228s2ria228s8i', 'AAAA', 'PPPPP' );
// 不特定部位挿入型シグナル -PPKKKRKV-を10残基目のアミノ酸残基の
// 直後に挿入する場合:
// HPSHPI.addSignalPeptide( 'http://scinets.org/item/cria228s2ria228s1i', 10 );
//戻り値:
//	なし
//---------------------------------------------------------------
Protein.prototype.addSignalPeptide = function( subject, position )
	{
		//指定されたシグナルペプチドの読み込み
		var signalPeptide = LinkData.getObjects( 'rdf1s292i', 'signal_peptide', subject,
												'http://linkdata.org/property/rdf1s292i#sequence' ).toString();
		
		//挿入部位の情報を読み込み
		var location = LinkData.getObjects( 'rdf1s292i', 'signal_peptide', subject,
										   'http://linkdata.org/property/rdf1s292i#location' ).toString();
		//シグナルペプチド中のXXX部分の置き換えに用いる引数の開始位置。
		//末端に挿入されるシグナルペプチドなら2番目以降の引数が用いられるが、
		//不特定の場合には2番目の引数は挿入位置を示すため、3番目以降になる。
		var start = 2;
		var inputSeq = this.getSequence();
		var outputSeq;
		var i;
		
		//シグナルペプチドから挿入部位を示すハイフンを除去
		signalPeptide = signalPeptide.replace( /-/g , '' );
		switch( location )
		{
			//N末端
			// 元データの綴り間違いと正しい綴りの両方に対応
			case 'N-terminus':
			case 'N-teminus':
				outputSeq = signalPeptide+inputSeq;
				break;
			//C末端
			case 'C-terminus':
				outputSeq = inputSeq+signalPeptide;
				break;
			//不特定
			case 'Any':
				if( position > inputSeq.length || position < 0 )
				{
					throw new Error( 'シグナルペプチドの挿入位置が不正です。(挿入位置:' + position + ')' );
				}
				outputSeq = inputSeq.slice( 0, position ) + signalPeptide + inputSeq.slice( position, inputSeq.length );
				start = 3;
				break;
		}

//シグナルペプチドに未確定のXを含む場合には、その部分に2番目以降
		//(挿入位置が不特定の場合には3番目)の引数を順番に当てはめていく。
		for( i = start - 1; i < arguments.length; i++ )
		{
			outputSeq = outputSeq.replace( /X+/i , arguments[ i ] );
		}

return new Protein( outputSeq );
	};

//---------------------------------------------------------------
//Proteinクラスのメンバ _getGeneticCodeTableメソッド
//概要:
//	コドン頻度表を取得し、連想配列に格納。
//引数:
//	workId		LinkData上のコドン頻度表のwork ID
//	filename	LinkData上のコドン表のファイル名
//戻り値:
//	コドン頻度表を格納した連想配列
//---------------------------------------------------------------
Protein.prototype._getGeneticCodeTable = function( workId, filename )
	{
		//遺伝暗号表を格納する連想配列
		var geneticCodeTable = {};
		//一時的にあるアミノ酸に対応するコドンを添字にしてその頻度を格納する連想配列
		var fraction = {};
		var subjects = LinkData.getSubjects( workId, filename );
		var i;
		
		for( i = 0; i < Protein._alphabet.length; i++ )
		{
			var j;
			for( j = 0; j < subjects.length; j++ )
			{
				var aa = LinkData.getObjects( workId, filename, subjects[ j ],
											 'http://linkdata.org/property/' + workId + '#one-letter%20code%20of%20amino%20acid' ).toString();
				
				if( aa === Protein._alphabet[ i ] )
				{
					var codon= subjects[ j ].toString().split( '#' )[1];
					fraction[ codon ] = LinkData.getObjects( workId, filename ,subjects[ j ],
															 'http://linkdata.org/property/' + workId + '#usage' ).toString();
				}
			}
			geneticCodeTable[ Protein._alphabet[ i ] ] = fraction;
			fraction = {};
		}

return geneticCodeTable;
	};

//---------------------------------------------------------------
//Proteinクラスのメンバ _DHondtメソッド
//概要:
//	比例代表選挙の各政党への議席数の割り振りに用いられる
//	ドント方式を応用して、与えられたコドンの使用頻度から
//	タンパク質の逆翻訳時に使用される各コドンの個数を算出し、
//	その情報を配列に格納して返す。
//引数:
//	totalSeatsNum	タンパク質を構成するあるアミノ酸の総数(総議席数に相当)
//	ratio			各コドンの頻度を含む連想配列(得票数に相当)
//戻り値:
//	コドンを添え字にし、そのコドンの使用数を持つ連想配列
//---------------------------------------------------------------
Protein.prototype._DHondt = function( totalSeatsNum, ratio )
	{
		var max;
		var maxParty;
		var gottenSeats = {};
		var divisor = {};
		var i;
		
		for( i in ratio )
		{
			if( ratio.hasOwnProperty( i ) )
			{
				gottenSeats[ i ] = 0;
				divisor[ i ] = 1;
			}
		}

for( i = 0; i < totalSeatsNum; i++ )
		{
			var party;
			max = 0;
			for( party in ratio)
			{
				if( ratio.hasOwnProperty( party ) )
				{
					if( max < ( ratio[ party ] / divisor[ party ] ) )
					{
						maxParty = party;
						max = ratio[ maxParty ] / divisor[ maxParty ];
					}
				}
			}
			gottenSeats[ maxParty ]++;
			divisor[ maxParty ]++;
		}
		return gottenSeats;
	};

//---------------------------------------------------------------
//Proteinクラスのメンバ _getAmniAcidCompositionメソッド
//概要:
//	シーケンス中に各アミノ酸が何残基ずつ存在するかを返す。
//引数:
//	inputSeq	対象になるシーケンスの文字列
//戻り値:
//	アミノ酸を添え字にし、そのアミノ酸がシーケンス中で
//	使用された回数を持つ連想配列
//---------------------------------------------------------------
Protein.prototype._getAminoAcidComposition = function( inputSeq )
	{
		var numOfAA = {};
		var i;

//配列AAnumの初期化
		for( i = 0; i < Protein._alphabet.length; i++ )
		{
			numOfAA[ Protein._alphabet[ i ] ] = 0;
		}

for( i = 0; i < inputSeq.length; i++ )
		{
			numOfAA[ inputSeq.charAt( i ) ]++;
		}
		return numOfAA;
	};

//---------------------------------------------------------------
//Proteinクラスのメンバ _getIdealCodonCompotitionメソッド
//概要:
//	タンパク質のアミノ酸組成とコドンの使用頻度に基づいて、
//	各コドンの最適な使用回数を算出する。
//引数:
//	geneticCodeTable	頻度情報を含むコドン表のデータ
//	inputSeq			対象になるシーケンスの文字列
//戻り値:
//	アミノ酸を添え字にし、そのアミノ酸の最適な使用回数を持つ連想配列
//---------------------------------------------------------------
Protein.prototype._getIdealCodonCompotition = function( geneticCodeTable, inputSeq )
	{
		var numOfAA = this._getAminoAcidComposition(inputSeq);
		var idealCompo = {};
		var aa;
		for( aa in geneticCodeTable )
		{
			if( geneticCodeTable.hasOwnProperty( aa ) )
			{
				idealCompo[ aa ] = this._DHondt( numOfAA[ aa ], geneticCodeTable[ aa ] );
			}
		}
		return idealCompo;
	};

//---------------------------------------------------------------
//Proteinクラスのメンバ _getIdealCodonCompotitionメソッド
//概要:
//	タンパク質を逆翻訳し、結果をDNAオブジェクトで返す。
//引数:
//	workId		LinkData上のコドン頻度表のwork ID
//	filename	LinkData上のコドン表のファイル名
//戻り値:
//	逆翻訳結果のシーケンスが格納されたDNAオブジェクト
//---------------------------------------------------------------
Protein.prototype.reverseTranslate = function( workId, filename )
	{
		//遺伝暗号表の取得
		var geneticCodeTable = this._getGeneticCodeTable( workId, filename );
		//終止コドン付加
		var inputSeq = this.getSequence();
		//最適なコドンの使用頻度の取得
		var idealComposition = this._getIdealCodonCompotition( geneticCodeTable, inputSeq );
		//あるアミノ酸に対応するコドンを一時的に格納する配列
		var codons = [];
		//あるアミノ酸ごとに使用するコドンを使用する個数だけ使用する順に詰めたキュー配列
		var tQueue = [];
		//アミノ酸ごとにtQueueの内容を格納したキュー配列
		var codonQueue = {};
		//コドンを使用頻度順にソートするための関数
		var sortCodons = function( a, b ) { return b.number - a.number; };
		//塩基配列を書き出す先
		var outputSeq = '';
		var aa;

for( aa in idealComposition )
		{
			if( idealComposition.hasOwnProperty( aa ) )
			{
				var codon;
				var i;
				for( codon in idealComposition[ aa ] )
				{
					if( idealComposition[ aa ].hasOwnProperty( codon ) )
					{
						//コドンとその頻度を配列に格納
						codons.push( { 'codon' : codon, 'number' : idealComposition[ aa ][ codon ] } );
					}
				}
				//使用頻度順にコドンをソート
				codons.sort( sortCodons );

//tQueueに使用する順にコドンを詰め込む
				for( i = 0; i < codons.length; i++ )
				{
					var j;
					for( j = 0; j < codons[ i ].number; j++ )
					{
						tQueue.push( codons[ i ].codon );
					}
				}
				codonQueue[ aa ] = tQueue;
				codons = [];
				tQueue = [];
			}
		}

//実際にコドンを並べていく。
		for( i = 0; i < inputSeq.length; i++ )
		{
			outputSeq += codonQueue[ inputSeq.charAt( i ) ][ 0 ];
			codonQueue[ inputSeq.charAt( i ) ].shift();
		}
		return new DNA( outputSeq );
	};

細胞壁固定型酵素発現によるホルムアルデヒド無毒化植物のデザイン

望月正弘

1. プログラムの流れ

(1) Pseudomonas putidaのホルムアルデヒド脱水素酵素 (FDH) のアミノ酸配列を取得する。
(2) FDHに小胞体移行シグナルを付加する。
(3) (2)を逆翻訳する。
(4) Arabidopsis thalianaのリボソームタンパク質P1-1 (P1) をコードする遺伝子の塩基配列を取得する。
(5) P1のリンカー部分に相当する領域を切り出す。
(6) Heterodera schachtiiのセルロース結合タンパク質 (CBP) のアミノ酸配列を取得する。
(7) CBPから小胞体移行シグナルを除去した断片を生成する。
(8) (7)を逆翻訳する。
(9) (3)、(5)、(8)の配列をN末端から順に結合し、一つの融合遺伝子とする。

2. デザインの狙い

　本デザインは、細胞壁固定型ホルムアルデヒド脱水素酵素を植物に発現させることで、植物体周辺のホルムアルデヒドを重点的に無毒化することを目指したものである。加えて、現実的な活用法として、本デザインによる組換え植物をホルムアルデヒド無毒化繊維の原料とすることを提案する。

2-1. 不均化反応による細胞外でのホルムアルデヒド無毒化

　本デザインは、第1回GenoConで優秀アイデア賞を受けた田中祐輔氏のアイデアに着想を得たものである。田中氏は、細胞外でホルムアルデヒドを分解することを意図して、植物にホルムアルデヒド脱水素酵素を分泌させるアイデアを考案した[1]。研究者Cは田中氏のアイデアを元に好気性真正細菌P. putidaのホルムアルデヒド脱水素酵素 (FDH) の遺伝子を植物に組み込み、そのアイデアの有効性を実証した[2]。このFDHはその名の通り、ホルムアルデヒドから水素原子を取り去って酸化し、ギ酸へと分解する活性を有している。
反応1: HCHO + NAD⁺ + H₂O → HCOOH + NADH + H⁺
　細胞外に分泌された酵素による無毒化には、有害なホルムアルデヒドが細胞へ侵入する前にそれを無毒化できるという優位性が存在する。事実、研究者Cのデザインは、細胞内での無毒化を狙った研究者A・研究者Bのデザインと比べて高いホルムアルデヒド耐性を示し、一般の参加者と同じベクターを用いたデザインの中では最良のスコアを得るに到った。本デザインでも高いホルムアルデヒド耐性の獲得を目指して、研究者Cと同じくFDHを分泌させるアプローチを採用した。
　しかし、このアプローチには一つの疑問が存在する。ホルムアルデヒド (HCHO) 以外に、電子受容体として酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド (NAD⁺)を消費するこの反応は、細胞外で持続的且つ効率的に進行しうるのだろうか。植物の細胞外NAD濃度の報告は見つからなかったが、動物での報告ではその濃度は細胞内よりもずっと低く、概ね1μM以下とされる[3]。また、アポプラストが培地と連続している植物の根においては、細胞外NADが培地中に拡散してしまう可能性があり、なおさら高濃度のNADが維持されているとは考えづらい。従って、研究者Cのデザインによる組換え植物が実験審査においてmMレベルのホルムアルデヒドを含む培地で生育できたことを考慮すれば、反応1のみでFDH導入によるホルムアルデヒド耐性獲得を説明することは難しい。
　一方、P. putidaのFDHは反応1の他に下記の反応を触媒することが知られている[4]。
反応2: HCHO + NADH + H⁺ → CH₃OH + NAD⁺
ホルムアルデヒドが酸化される反応1とは対照的に、反応2ではホルムアルデヒドが還元されメタノールが生成される。反応1と反応2が等しく進行すると仮定すると、両反応は下記の反応3と見なすことができる。
反応3: 2HCHO + H₂O → HCOOH + CH₃OH
この反応は不均化 (dismutation) と呼ばれる。面白いことに、FDHがこの反応を触媒するためには一時的な電子伝達体として酸化型あるいは還元型のいずれかのNADを必要とするが、還元と酸化が一対になって起こるためにいずれの型のNADも消費しない。さらに生理的なpHにおいてはFDHは非共有結合的にではあるが強固にNADを結合しているとされ、NADの解離を伴わずに反応3が進行するという[5]。
以上のようなFDHの性質を踏まえ、研究者Cのデザインにおけるホルムアルデヒド耐性発現のメカニズムとして、私は以下の様なモデルを想定した。
小胞体移行シグナルを付加されたFDHが粗面小胞体で合成される。
FDHは小胞体内部でNADを結合する。小胞体内部にはミクロソーム電子伝達系が存在するため、元来十分な量のNADが存在するものと思われる。
エキソサイトーシスによりNADを結合したFDHが細胞外に分泌される。
FDHは細胞外でNADを結合したまま反応3を連続的に触媒し、有害なホルムアルデヒドを消費してギ酸とメタノールを生成する。

　なお、研究者Cによるデザインではギ酸脱水素酵素も細胞外に分泌されるように設計されていたが、(1) ギ酸脱水素酵素がFDHと同様に細胞外でギ酸を効率的に無毒化できるとする根拠は見当たらず、おそらくは実質的には機能していないものと推定されること、(2) ホストのギ酸脱水素酵素である程度はギ酸の毒性に対処できると思われること、(3)両方の酵素をデザインに組み入れると規定の2000 bpを超過してしまうことから本デザインにはギ酸脱水素酵素を含めないものとした。

2-2. ホルムアルデヒド脱水素酵素の細胞壁固定による重点的無毒化

　小胞体移行シグナルを付加したタンパク質の遺伝子を導入した植物は、根から培地中にそのタンパク質を分泌するとの報告がある[6]。従って、研究者Cのデザインによる組換え植物でも、FDHが培地中に分泌されているものと推測される。一見すると、FDHが根から分泌されて培地中に拡散することは、培地中のホルムアルデヒドを広く効率的に無毒化するというの観点からは好都合に思える。しかし、GenoConの実験審査のスコアはホルムアルデヒドの分解量ではなく、植物のホルムアルデヒド耐性の程度によって計算されることに留意する必要がある。実験審査でハイスコアを獲得するためには、ホルムアルデヒドを"広く薄く"無毒化するよりも、むしろ植物体周辺のホルムアルデヒドを"重点的に"無毒化する方が植物体に対する保護効果が高く有利と私は考えた。
　そこで、本デザインではFDHに線虫H. schachtiiのセルロース結合蛋白質(CBP)を融合させることで、FDHを細胞壁に留まらせる工夫を施した。この融合酵素は、細胞外に分泌されてもセルロースを主成分とする細胞壁に繋ぎ止められ、根から培地中に拡散しにくいものと期待される。なお、融合タンパク質の設計に当たってはFDHの高次構造を考慮し、FDHのC末端への融合が立体障害を引き起こさないであろうことを確認した (図2) 。加えて、融合タンパク質中でFDH部分とCBP部分が独立したドメインとして機能するように、両者の間にリボソームタンパク質P1-1 由来のリンカー配列を挿入した。また、CBPが元来保持している小胞体移行シグナルは、融合によってN末端に露出しなくなるため機能しないと思われること、そもそもA. thalianaをホストにした場合には機能しないという報告[7]があることから削除した。

2-3. 組換え植物を原料にしたホルムアルデヒド無毒化繊維の実用化の可能性

　ホルムアルデヒド無毒化能を有する機能性材料としては、TanakaらによるFDHを固定した高分子膜の例がある[8]。植物繊維の主成分は細胞壁に由来するセルロースであり、本デザインに基づく組換え植物から採取した繊維にもFDHが保持されている可能性がある。そうだとすれば、この繊維はTanakaらによる高分子膜と同様の活性を示し、ホルムアルデヒド無毒化繊維として機能するものと期待される。
　生きたままの組換え植物を実験室の外で利用するためには、生態系への影響等を考慮する必要があり、制度上のハードルも低くはない。一方、繊維のような"死んだ"材料であれば、それが組換え植物に由来するものでも、そのハードルを下げることができる。例えば、組換え植物由来のホルムアルデヒド無毒化繊維を空気清浄機のフィルターに織り込むというような使用法ならば、比較的容易に生活環境での実地試験に漕ぎ着けるだろう。本デザインで採用した不均化反応による無毒化は、2-1で述べたように生細胞の代謝系に依存せず単独の酵素で機能するという特質を有していると見られるため、こうした無生物的材料での利用に適している。

3. 参考文献

田中祐輔 GenoCon2010レポートhttps://database.riken.jp/sw/wiki/ja/cria303s1ria303s1i/
GenoCon2010 実験審査結果 https://database.riken.jp/sw/wiki/ja/cria303s2ria303s1i/
T. O'Reilly, D. F. Niven, Canadian journal of veterinary research = Revue canadienne de recherche vétérinaire 67, 229 (2003). [Pubmed]
N. J. Oppenheimer, G. T. Henehan, J. A. Huete-Pérez, K. Ito, Advances in experimental medicine and biology 414, 417 (1997). [Pubmed]
N. Tanaka, Y. Kusakabe, K. Ito, T. Yoshimoto, K. T. Nakamura, Journal of molecular biology 324, 519 (2002). [Pubmed]
N. V. Borisjuk, et al. , Nature biotechnology 17, 466 (1999). [Pubmed]
T. Hewezi, et al. , The Plant cell 20, 3080 (2008). [Pubmed]
N. Tanaka, et al. , ACS applied materials & interfaces 1, 228 (2009).[Pubmed]

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2-1. 不均化反応による細胞外でのホルムアルデヒド無毒化

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2-3. 組換え植物を原料にしたホルムアルデヒド無毒化繊維の実用化の可能性

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